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摘要：帕金森病（PD）的特征是黑質（SN）多巴胺能（DA）神經元的缺失和α-突觸核蛋白（α-syn）的聚集。目前的 PD 療法僅提供癥狀緩解，缺乏可以逆轉正在進行的神經退行性變的疾病緩解治療策略。在探索新的疾病治療策略過程中，來自天然來源的化合物近來備受關注。YIAEDAER（Tyr-Ile-Ala-Glu-Asp-Ala-Glu-Arg）肽是從海洋蝸牛（NAC）的內臟物質提取物中分離純化的一種多功能肽，具有豐富的藥理活性，但其對MPTP誘導的PD模型的神經保護作用尚未見報道。研究發現YIAEDAER肽聯合治療可以抑制MPTP誘導的斑馬魚運動損傷，改善MPTP誘導的DA神經元變性，抑制血管系統及腦血管的喪失，抑制α-syn水平。此外，YIAEDAER肽調節與自噬（α-syn、pink1、parkin、atg5、atg7、beclin1、ulk1b、ulk2和ambra1a）和氧化應激（sod1、sod2、gss、gpx4a、gsto2和cat）相關的幾個基因。因此，我們的發現表明，YIAEDAER肽可能是對抗MPTP誘導的PD樣疾病的潛在治療候選物。

關鍵詞：MPTP α-突觸核蛋白 天然產物 自噬  氧化應激  斑馬魚

簡介：帕金森病 (PD) 是第二常見的破壞性神經退行性疾病，目前尚無有效的治療選擇。帕金森病的神經病理學特征包括多巴胺能（DA）神經元的逐漸喪失，伴隨著神經元胞體和突起中路易小體的積累，以纖維α-突觸核蛋白聚集體為主。大多數PD病例是散發性的，而5–10%的PD病例被認為是由特定基因的遺傳突變引起的，包括SNCA（一種編碼α-syn的基因）、富含亮氨酸重復激酶2（lrrk2）、Parkin（Parkin）（Parkin）和磷酸酶和張力蛋白同源物（pten）誘導的假定激酶1（pink1）。帕金森病伴有運動和非運動癥狀。運作癥狀主要表現為運動障礙，表現出運動遲緩、靜止性震顫和強直等主要運動癥狀。然而，非運動癥狀，包括注意力下降、REM睡眠行為障礙和嗅覺減退，可能比運動癥狀早幾年。其他非運動癥狀也可能出現，在疾病晚期，會出現姿勢不穩和癡呆。運動癥狀只有在50-60%的DA神經元變性時才會出現，從而使紋狀體中的多巴胺含量降低70-80%，導致基底節活動失調。盡管在精確理解帕金森病神經退行性變過程相關的分子途徑方面取得了令人信服的進展，但尚未開發出能夠改變帕金森病進展的治療干預措施。這反映出迫切需要開發新的抗PD療法，有效地阻止疾病的進展。在探索新的 PD 療法的過程中，來自自然資源的化合物在近來受到了越來越多的關注。在當前研究中感興趣的化合物是YIAEDAER肽，它是一種多功能肽，從海海洋蝸牛的內臟物質提取物（NAC）中分離和純化。NAC是一種具有很高營養價值和商業價值的海生蝸牛；然而，對其活性肽知之甚少。早期的實驗研究已經從NAC的肉和內臟中分離出YIAEDAER肽，并報道了其抗氧化、血管緊張素轉換酶（ACE）抑制和抗糖尿病活性。YIAEDAER肽由Tyr-Ile-Ala-Glu-Asp-Ala-Glu-Arg組成，分子量為965 Da。 研究發現，YIAEDAER 肽的觀察到的生物活性歸因于其低分子量、高比例的疏水性和帶負電荷的氨基酸，以及特定的 C 端和 N 端氨基酸。神經毒素MPTP被廣泛用于誘導PD，導致SN中DA神經元選擇性變性，主要通過抑制線粒體呼吸鏈復合物1（通過單胺氧化酶B產生的有毒代謝物MPP+）來重現帕金森病癥狀。斑馬魚是一種淡水魚，近年來作為一種強大的體內脊椎動物模型生物而受到越來越多的關注，可治療多種神經退行性疾病。斑馬魚模型經濟，易于飼養，與人類的遺傳相似性超過 80%。盡管斑馬魚和人類之間存在進化距離，但斑馬魚基因相對于人類同源基因在功能上是保守的，因此它們表現出與人類相似的神經退化表型。值得注意的是，斑馬魚擁有脊椎動物的神經結構組織，所有的主要結構都與哺乳動物的大腦相似。斑馬魚已針對幾種中樞神經系統 (CNS) 疾病進行建模，包括癲癇、阿爾茨海默病 (AD)、創傷性腦損傷 (TBI) 和 PD。斑馬魚作為珍貴模型的潛力為未來的神經科學研究增添了新的見解。與嚙齒動物模型相比，斑馬魚整個胚胎發育過程中的快速神經發育和光學透明性使其成為研究 PD 相關疾病（如 PD）的合適模型。馬魚PD模型成為一種廣泛接受的可靠模型，可以研究抗PD化合物及其相關的潛在機制。在目前的研究中，我們評估了YIAEDAER肽對MPTP誘導的斑馬魚PD模型的神經保護作用，并研究了YIAEDAER肽抗PD作用背后的潛在機制。

YIAEDAER聯合治療對MPTP誘導的運動障礙的影響：為了評估YIAEDAER肽的聯合治療是否能改善MPTP誘導的運動損傷，我們在120 hpf時對斑馬魚仔魚進行了行為評估，這是斑馬魚表現出最大自發運動的最早時間點。與對照組相比，MPTP治療組的總行程顯著縮短。相反，與YIAEDAER肽的聯合治療逆轉了MPTP誘導的總行程縮短。然而，與 MPTP 組相比，僅10 μg/mL 和  50 μg/mL 的 YIAEDAER組顯示總行駛距離顯著上升。此外，斑馬魚的游泳速度與總行程呈相似的模式。 2 μg/mL、10 μg/mL和 50 μg/mL的YIAEDAER均逆轉了MPTP誘導的游泳速度下降，反映YIAEDAER肽對運動模式具有保護作用。綜上所述，結果表明 YIAEDAER 肽改善了 MPTP 誘導的斑馬魚運動活動的降低。

圖1、試驗流程圖

圖 2、 YIAEDAER 對斑馬魚仔魚 PD 樣行為的緩解作用。

YIAEDAER聯合治療對斑馬魚仔魚對刺激的反應損傷的影響：圖3顯示了120 hpf仔魚在10min 的最少適應后，突然從黑暗變為光明時的60min內的運動輸出特征模式。對照組的仔魚在黑暗期運動能力急劇增加后逐漸減少，而MPTP處理的斑馬魚的運動能力并沒有明顯增加。簡而言之，對照和 50 μg/mL 的 YIAEDAER肽組斑馬魚在明亮刺激后的反應能力增強。

圖3、YIAEDAER聯合治療對斑馬魚仔魚對刺激的反應損傷的影響。

YIAEDAER 對 MPTP 誘導的 DA 神經元和血管損失的影響：MPTP導致斑馬魚DA神經元顯著缺失。為了評估YIAEDAER肽對MPTP誘導的DA神經元丟失的抑制作用，我們使用轉基因系Vmat2:GFP進行了評估。96 hpf 的 MPTP 組斑馬魚顯示 DA 神經元區域的長度和熒光密度降低，這與我們早期的研究相似。與YIAEDAER肽的聯合治療以濃度依賴性方式逆轉了斑馬魚中腦的這種減少，如紅色方框所示。在96 hpf的轉基因斑馬魚（Fli1:GFP）中評估了YIAEDAER肽對MPTP誘導的神經血管系統的保護作用。在目前的研究中，MPTP給藥導致了腦血管的顯著損失，如圖4D中的紅色箭頭所示，與早期記錄的研究相證實。另一方面，如藍色箭頭所示，與 YIAEDAER 肽（2 μg/mL、10 μg/mL 和 50 μg/mL）共同處理可保護 MPTP 誘導的脈管系統喪失和脈管系統紊亂。

圖 4、 YIAEDAER肽對斑馬魚 PD 模型中 DA 神經元和血管的保護作用。

 YIAEDAER肽對斑馬魚仔魚α-syn水平的調節作用：如紅色箭頭所示，與對照組相比，經MPTP處理的斑馬魚仔魚中樞神經系統中的α-syn表達增加。在72 hpf下，通過斑馬魚仔魚上的綠色箭頭觀察到YIAEDAER聯合治療組的α-syn水平明顯降低。此外，與 MPTP 組相比，YIAEDAER 肽 (2 μg/mL)、(10 μg/mL) 和 (50 μg/mL) 以劑量依賴性方式顯著抑制 α-syn 的表達。

圖 5、 YIAEDAER肽通過調節斑馬魚仔魚 α-syn 水平對 PD 樣癥狀起緩解作用。

YIAEDAER 肽對斑馬魚 PD 模型中 ROS 生成的影響： 120 hpf 斑馬魚仔魚經 MPTP 處理熒光圖像顯示，與對照相比，ROS 生成增加。 然而，與 YIAEDAER 肽（2 μg/mL、10 μg/mL 和 50 μg/mL）共同處理會抑制 ROS 的產生。同對照與YIAEDAER肽（2?微克/毫升，（10?μg/mL）和（50?微克/毫升）聯合治療組以劑量依賴性方式顯著抑制ROS水平的強度相比，MPTP 組 ROS 水平的熒光強度顯著增加。

圖 6  在斑馬魚 PD 模型中YIAEDAER肽對 ROS 生成的作用。

YIAEDAER肽對自噬相關基因mRNA表達的影響：簡單地說，自噬是負責清除受損蛋白質和細胞器的過程，與帕金森病有關。α-突觸核蛋白（α-syn）、e3泛素蛋白連接酶（parkin）、PTEN誘導的假定激酶1（pink1）、自噬相關基因5（atg5）、自噬相關基因7（atg7）、beclin1、ulk1b、ulk2、ambra1a已被確認參與PD自噬的調節。為了研究 YIAEDAER 聯合治療通過調節自噬改善 MPTP 誘導的 PD 樣狀況，我們評估了這些基因的 mRNA 表達水平。parkin 或 pink1 的缺陷不僅會導致功能失調的線粒體的積累和 ROS 的釋放，而且還會導致 LBs 的積累，包括 α-syn。與對照組相比，MPTP組的α-syn轉錄水平顯著上調，而YIAEDAER肽以濃度依賴性方式逆轉了這種增加。與對照組相比，MPTP給藥組的pink1和parkin mRNA表達顯著增加。與  2 μg/mL、10 μg/mL 和50 μg/mL的YIAEDAER 肽共處理后，pink1 的 mRNA 表達顯著降低。 然而，與 MPTP 組相比，小劑量(2 μg/mL)  YIAEDAER 肽的聯合治療僅對 parkin 的 mRNA 表達產生抑制作用。然而，中、高劑量的YIAEDAER肽對parkin的mRNA表達沒有任何影響。與對照組相比，MPTP組atg5和atg7的mRNA表達水平顯著降低。

圖7、YIAEDAER肽治療后自噬相關基因的表達。

YIAEDAER肽對氧化應激相關基因mRNA表達的影響：氧化應激在帕金森病發病機制中的作用已得到充分證實。PD的特點是線粒體系統失調，表現為ROS的產生和隨后的釋放增加。為了了解 YIAEDAER 肽對 MPTP 誘導的氧化應激的影響，我們評估了幾個與氧化應激相關的基因的 mRNA 表達。MPTP治療組與對照組相比，sod1的mRNA表達水平無顯著差異。令人驚訝的是，與YIAEDAER肽的聯合治療 (2?μg/mL, 10?μg/mL, and 50?μg/mL)與MPTP組相比，sod1的mRNA表達水平沒有發生任何顯著變化。與對照組相比， MPTP 處理組 sod2 和 gss 的 mRNA 表達水平顯著增加。 相反，與MPTP組相比，YIAEDAER肽(2 μg/mL)、(10 μg/mL)和(50 μg/mL)聯合治療組劑量依賴性地降低sod2的mRNA表達水平。此外，僅在中（10 μg/mL）和高（50 μg/mL）劑量的 YIAEDAER 肽中觀察到 gss 的 mRNA 表達水平顯著下降。

圖8、YIAEDAER肽治療后氧化應激相關基因的表達。

討論：PD是一種無法治愈的神經退行性疾病，其中α-syn在中樞和周圍神經系統神經元的死亡和功能障礙中發揮著關鍵作用。雖然PD的發病機制復雜且不太清楚，但PD進展期間DA神經元的死亡與α-突觸核蛋白的異常聚集、氧化應激的升高、線粒體功能的功能障礙以及神經炎癥標記物的上調有關。在探索阻止疾病進展的新型抗PD治療策略的過程中，來自自然資源的化合物受到了越來越多的關注。在此，我們評估了 YIAEDAER 肽（2 μg/mL、10 μg/mL 和 50 μg/mL）在斑馬魚 MPTP 誘導的 PD 模型中的神經保護作用，以及抗自噬和氧化應激相關機制。 總的來說，我們發現YIAEDAER肽的抗PD作用與其濃度呈正相關，100 μg/mL的YIAEDAER肽顯示出最高的藥理活性。據報道，MPTP處理會對斑馬魚造成運動障礙。為了證實MPTP的急性效應，我們觀察到MPTP對斑馬魚的運動損傷，其特征是總行程和平均游泳速度減少。YIAEDAER肽對MPTP誘導的運動損傷具有改善作用，這一點通過總行程和游泳速度的增加而明顯。這種效應在中濃度和高濃度下都很明顯。帕金森病的特點是除了運動功能障礙外，還有一些非運動癥狀，如反應減退、癡呆和失眠，通常伴隨在運動功能障礙階段。我們的研究測試了仔魚對刺激的反應，以驗證YIAEDAER改善PD樣非運動癥狀的藥理活性。然而，當前研究的局限性在于，反應能力可能不是斑馬魚仔魚非運動癥狀的唯一指標，在進一步研究中，可能會結合更多的測試，包括睡眠和記憶，來研究非運動損傷活動。在嚙齒類動物或斑馬魚模型中，DA神經元細胞的丟失或DA變性是PD的關鍵特征。任何可能的抗PD治療都應該能夠改善PD腦內進行性DA神經元變性。YIAEDAER肽聯合治療以濃度依賴性方式改善了MPTP給藥誘導的DA神經元的丟失。因此，我們的發現為YIAEDAER肽可以拯救MPTP誘導的斑馬魚腦DA神經元丟失的設想提供了證據。血腦屏障（BBB）是神經與腦血管系統接口的重要組成部分。充足的血液供應以及血管的結構和功能完整性對大腦的正常功能至關重要，BBB功能障礙和腦血流量不足與包括PD在內的神經退行性疾病的發病機制有關。在目前的研究中，YIAEDAER肽聯合治療抑制了MPTP誘導的神經元血管系統和腦血管的丟失。α-syn通過聚集、突變或過度表達蛋白的錯誤折疊對神經元存活至關重要，α-syn失調可能會導致PD中的神經退行性變和DA神經元死亡。α-syn是一個14?kDa蛋白由140個氨基酸組成，在PD發病機制中已得到廣泛承認，其聚集導致神經退行性變和DA神經元死亡。在斑馬魚PD的MPTP模型中，α-syn的轉錄水平增加。我們的研究結果反映了 MPTP 治療組中 α-syn 的表達增加，這反過來在用 YIAEDAER 肽治療后受到抑制，這反映了 YIAEDAER 肽抑制 α-syn 表達的潛力，使其成為可能的抗 PD 療法。自噬被認為是一種重要的現象，細胞通過自噬去除受損的細胞器、錯誤折疊和異常聚集的蛋白質來維持細胞內環境穩定。自噬與PD之間存在著令人信服的相關性，因為自噬在清除聚集的錯誤折疊蛋白質和降解受損細胞器方面起著關鍵作用。Pink1和Parkin在PD自噬的分子調控中起到了關鍵作用。氧化應激反映了活性氧的產生和抗氧化防御系統之間的不平衡，它可能與包括帕金森病在內的幾種神經退行性疾病的發病機制和進展有關。PD動物模型中的ROS生成增加，這與我們觀察到的MPTP組ROS生成增加的情況類似。YIAEDAER 肽劑量依賴性地抑制 ROS 生成的強度，反映了其調節氧化應激的潛力。 同樣，YIAEDAER 肽治療調節了幾個與氧化應激相關的基因（sod1、sod2、gss、gpx4a、gsto2 和 cat）的 mRNA 表達，表明其具有抗氧化應激的潛力。

結論：綜上所述，目前的研究結果表明，YIAEDAER 肽主要通過抑制運動障礙、改善 DA 神經元的退化、抑制腦血管的損失來發揮抗 PD 活性。YIAEDAER肽潛在的抗PD作用可能是由于其在自噬和氧化應激中的調節作用。因此，YIAEDAER肽可能是一種很有前途的抗帕金森病治療候選藥物.

原文出自：Neuroprotective effect of YIAEDAER peptide against Parkinson’s disease like pathology in zebrafish - ScienceDirect