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摘要：抗癌藥物毒性大，對環境有很大的危害。本研究的目的是采用一種創新的方法評估trabectedin對斑馬魚肝細胞系（ZFL）和胚胎幼蟲的毒性。在 ZFL 細胞中，使用 MTT 和臺盼藍排除測定法測量trabectedin的細胞毒性，并通過熒光激活細胞分選 (FACS) 和免疫熒光分析評估細胞形態。就死亡率/細胞活力而言，Trabectedin對ZFL細胞的毒性是斑馬魚胚胎幼蟲的60倍，在42.7μg/L時觀察到胚胎幼蟲死亡， 0.04μg/L時觀察到培養細胞無活力。免疫熒光染色顯示在0.04至0.15μg/L范圍內暴露于trabectedin的ZFL細胞的形態學改變呈劑量依賴性. 此外，trabectedin在濃度低于50.3μg/L時會導致斑馬魚胚胎幼蟲的形態異常，例如尾部畸形、心包水腫和缺乏平衡。關于幼蟲行為分析，在黑暗條件下暴露于42.7μg/L的 trabectedin增加了斑馬魚的速度和總距離。這些結果表明，trabectedin對體外和體內斑馬魚模型中都是有毒的，因此，這種抗癌劑在環境中的出現和持續存在可能是生物群的一個潛在風險因素。

關鍵詞：抗癌劑  斑馬魚的運動行為  ZFL細胞  發育毒性  細胞毒性

簡介：全世界有數以千萬計的患者接受化療，預測表明癌癥病例數量將大幅增加，從而導致抗癌藥物（AAs）的使用增加。在給患者服用AAs后，由于廢水處理廠對生活和醫院殘留水的處理效果有限，AAs及其各自的代謝物會釋放到環境中。多項研究表明，AAs 存在于水生環境系統中，例如順鉑、依托泊苷、多柔比星、環磷酰胺和他莫昔芬，濃度范圍為 0.22 至 86.2 ng/L，而在地下水中，AAs 的含量為 2.1 至 29.7 ng/L。由于其作用機制通常包括與DNA的相互作用，AAs具有遺傳毒性、致癌性、致突變性和/或致畸性，長期接觸的情況下可能會對水生生物產生不良影響。已檢測到飲用水中存在 AA，置環境和人類健康于危險之中。然而，水生環境中 AA 的存在及其對水生生物群和人類健康的影響尚未得到充分研究。trabectedin用于治療軟組織肉瘤，于 2007 年進入歐洲市場，八年后進入美國市場。分子通過結合DNA富含鳥嘌呤的特定序列，進而影響修復機制、轉錄調節和腫瘤微環境，從而維持其抗癌作用。與在高濃度 下具有細胞毒性的典型 DNA 嵌插劑（例如替莫唑胺和鉑化合物）不同，trabectedin在較低濃度下具有活性。正在進行的研究和臨床試驗進一步表明，trabectedin對骨肉瘤和結直腸腫瘤等其他類型的腫瘤有很好的治療前景。考慮到trabectedin在治療方案中的使用越來越多，單獨使用或與靶向治療中的其他AAs結合使用，其在環境中已經存在的可能性很高。因此，了解trabectedin在水生系統中的作用，了解其在環境中的持久性（半衰期）以及在水、污水污泥和廢水中的檢測值至關重要。大多數現有研究涉及trabectedin對哺乳動物和非人類測試模型的影響，重點關注對人類健康的直接影響，旨在更好地了解這種藥物的抗腫瘤潛力。因此，關于trabectedin的環境危害的信息存在重大空白。文獻中有關于AA對各種水生生物分類群的生態毒理學信息。5-氟尿嘧啶在低于 0.1 mg/L的水平下誘導生長抑制. 接觸順鉑21天會影響甲殼動物大型水蚤的繁殖量，EC50值為16μg/L。暴露于68μg/L環磷酰胺7天后會導致胚胎畸形。Gajski等人使用斑馬魚肝（ZFL）細胞系、人類肝癌（HepG2）細胞和人類外周血淋巴細胞（HPBLs）來評估5-氟脲嘧啶、順鉑和足葉乙甙的毒性，并表明非靶向ZFL細胞比癌細胞更敏感。AA 對非靶標生物和細胞的危害性增加，因此有必要探索trabectedin的生態毒理學潛力潛力。本研究旨在深入了解trabectedin的環境毒性，從而更好地了解trabectedin在環境中的處置和分散是否會影響淡水魚類。此外，本研究旨在建立體外細胞模型預測整體動物效應的可行性。

trabectedin對 ZFL 細胞活力和形態的影響：trabectedin在 24、48 和 72 小時后對 ZFL 細胞具有強烈的細胞毒性，IC50 值見表1。用作參比化合物的多柔比星在孵育 24、48 和 72 小時后的 IC50 值分別是觀察到的trabectedin的 50、40 和 12 倍。

表1、MTT法分析trabectedin和多柔比星（陽性對照）對ZFL細胞的細胞毒性。TB 分析顯示，與溶劑對照 (DMSO) 相比，所有測試濃度（0.04、0.08 和 0.15 μg.L-1）的trabectedin導致 ZFL 細胞活力顯著降低。由于本研究中陰性對照組和溶劑對照組之間未觀察到顯著的統計學差異，因此選擇溶劑對照組來比較我們的數據。進行 FACS 分析以檢查分別由 FCS 和 SSC 軸定義的單元大小和內部復雜性。隨著trabectedin濃度的增加，ZFL 細胞的直徑和粒度均有所降低。

圖 1. TB 排除法和流式細胞儀測定的 0.04、0.08 和 0.15 μg.L-1 trabectedin對 ZFL 細胞活力的影響。

為了進一步觀察ZFL細胞的形態，對微管、F-肌動蛋白和細胞核進行了免疫熒光染色。其中一個最顯著的影響是肌動蛋白絲的分布。對照細胞的外圍有密集的標記，但暴露于trabectedin的細胞中呈彌漫性取向。這種改變在用最高濃度藥物處理的細胞中得到了高度證實。

圖2、暴露24小時后，對照組和trabectedin處理的ZFL細胞的免疫熒光染色。

對胚胎幼蟲存活和發育的影響：trabectedin對斑馬魚胚胎幼蟲的急性影響如表2和圖3所示。在暴露 trabectedin24 小時后導致死亡，LC50 為 95.5 μg.L-1。 在隨后的接觸天數中，死亡率增加，在 96 小時時 LC50 值為 77.55 μg/L。暴露于trabectedin還對胚胎幼蟲造成亞致死效應，例如發育異常，包括體節改變、心包水腫、尾部畸形和缺乏平衡。在24 hpf時，唯一可觀察到的效應是體節改變，EC50為75.42μg/L。暴露發現心包水腫，在24、48和96 hpf時EC50分別為66.28、74.66和75.42μg/L。數值的增加并不意味著斑馬魚已經康復，而是意味著水腫魚在隨后的幾天內死亡，從而導致測量的亞致死效應明顯降低。還觀察到尾部畸形，在72 hpf時畸形增強，EC50為42.66μg/L。在 96 hpf 時發現幼蟲缺乏平衡。

圖3、暴露于trabectedin的96 hpf斑馬魚幼蟲的致畸顯微照片

關于 96 小時的死亡率和畸形，LOEC 值（以觀察到影響的最低濃度表示）為 42.66 μg/L，而 NOEC 值（以未觀察到影響的最高濃度表示）為22.47 μg/L。

Trabectedin對行為的影響: 在第一個黑暗時期觀察到暴露于最高濃度trabectedin的幼蟲的游泳速度和總距離顯著增加。在其他濃度和階段，未觀察到進一步的行為差異。對應于斑馬魚運動行為的LOEC值為42.66μg/L，而NOEC達到22.47μg/L。

結果：本研究揭示了抗癌劑trabectedin在相關的體外和體內生態毒理學，對斑馬魚的影響，從 ZFL 細胞系的細胞骨架成分到胚胎幼蟲的發育和斑馬魚幼蟲的運動。本研究揭示了抗癌劑trabectedin從ZFL細胞系的細胞骨架成分改變、胚胎幼蟲的發育和幼蟲的運動對斑馬魚的影響。Trabectedin 是一種劇毒藥物，對斑馬魚細胞（非靶細胞和正常細胞）的影響與腫瘤細胞相同。考慮到trabectedin的廣泛使用，這些研究結果支持了類似這項研究的必要性，以推斷trabectedin的潛在環境危害。斑馬魚細胞和胚胎的敏感性差異突出了斑馬魚細胞在減少不確定性和促進淡水系統保護方面的潛在用途。在相關生態環境中斑馬魚幼蟲胚胎細胞系系統是評估抗癌化合物毒性的合適工具。

原文出自：Effects of trabectedin in the zebrafish Danio rerio: from cells to larvae - ScienceDirect