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美鳳力臨床前大動物實驗中心
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當我們談?wù)撃z原蛋白時，不禁讓人想到皮膚的彈性、關(guān)節(jié)的靈活性以及血管的穩(wěn)定性，這種結(jié)構(gòu)蛋白是人體留住青春活力的重要因素。COL1A2基因作為組成膠原蛋白的幕后功臣，它在科學研究中也同樣扮演著關(guān)鍵角色。今天，小賽就為大家介紹一款利用Col1a2基因驅(qū)動iCre表達以實現(xiàn)靶向成纖維細胞的工具鼠模型——Col1a2-iCre小鼠（產(chǎn)品編號：C001528）。
Col1a2-iCre小鼠 COL1A2基因編碼I型膠原蛋白的pro-α2(I)鏈。I型膠原蛋白是人體內(nèi)含量最多的膠原蛋白，主要在成纖維細胞中表達。成纖維細胞是存在于全身結(jié)締組織中的細胞，包括皮膚、肌腱、韌帶和骨骼，因此I型膠原蛋白在為這些組織提供抗拉強度和結(jié)構(gòu)支撐方面起著至關(guān)重要的作用，并且參與許多生物學過程，如細胞遷移、細胞黏附和細胞信號傳導等。 賽業(yè)生物利用基因編輯技術(shù)自主研發(fā)構(gòu)建了Col1a2-iCre小鼠（產(chǎn)品編號：C001528），該模型在小鼠Col1a2基因調(diào)控元件的驅(qū)動下表達密碼子優(yōu)化后的Cre重組酶（iCre）。iCre重組酶表達模式與內(nèi)源基因相似，且內(nèi)源性Col1a2基因表達不受影響。當Col1a2-iCre小鼠與含有l(wèi)oxP位點的小鼠雜交后，子代小鼠可在成纖維細胞中引發(fā)由Cre重組酶介導的loxP位點間的序列重組。
皮膚、心臟和肺部的Cre重組活性 將Col1a2-iCre小鼠與條件性表達tdTomato熒光蛋白的Rosa26-LSL-tdTomato小鼠交配，采集子代小鼠的各組織并通過免疫熒光（IF）檢測確定Cre重組酶的表達。結(jié)果顯示在Cre+小鼠的皮膚、心臟和肺部組織中檢測到紅色熒光信號。 
總 結(jié) 在Col1a2-iCre小鼠（產(chǎn)品編號：C001528）中，根據(jù)組織學形態(tài)結(jié)構(gòu)分析，推測皮膚真皮層、心肌細胞之間、心臟瓣膜及心內(nèi)膜、肺支氣管、肺泡中發(fā)生Cre重組的細胞主要為成纖維細胞。因此，Col1a2-iCre小鼠可用于靶向成纖維細胞的組織特異性研究。
問：在驗證Cre工具鼠的重組效率時，如果遇到難以獲取的組織和細胞，應(yīng)該如何確認熒光表達的情況呢？
答：當驗證Cre工具鼠在特定組織或細胞中的重組效率時，我們常常使用Cre工具鼠與報告小鼠（如Rosa26-LoxP-Stop-LoxP-tdTomato或EGFP）交配，以觀察子代中目標組織或細胞的熒光表達情況。然而，對于一些難以獲取的組織或細胞，確認熒光表達可能會變得困難。在這種情況下，可以采用以下幾種方法來解決問題： 1. 細胞分選： 流式細胞術(shù)或者磁珠分選可以高效地分離和分析特定熒光標記的細胞群體，如果目標細胞可以從組織中分離出來，使用流式細胞術(shù)可以來檢測細胞中的熒光表達情況，適用于CD系列細胞等。 舉例：將Cd19-Cre小鼠（產(chǎn)品編號：I001184）與條件性表達tdTomato熒光蛋白的Rosa26-LSL-tdTomato小鼠交配，產(chǎn)生雙基因雜合子代小鼠。采集雙基因雜合子代小鼠的外周血、脾臟和骨髓組織并通過流式細胞術(shù)分析tdTomato蛋白的分布，最終可確定Cre重組酶在B細胞中的高表達。 2. 細胞標記物： 細胞標記物抗體可以用于識別不同類型的細胞，通過細胞標記物和熒光的共定位能夠精確定位和定量分析特定細胞中的Cre介導的重組情況，適用于已有商業(yè)化細胞標記物的免疫細胞、神經(jīng)細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、癌癥標記等。 舉例：Cr1-iCre小鼠（產(chǎn)品編號：C001391）與條件性表達tdTomato熒光蛋白的Rosa26-LSL-tdTomato小鼠交配，產(chǎn)生雙基因雜合子代小鼠。采集雙基因雜合子代小鼠的腦、皮膚、肝、腎、腸、脾和肺組織等組織，使用小膠質(zhì)細胞標記物IBA1抗體和Tomato紅色熒光抗體共定位，最終可確認Cre重組酶主要定位于腦組織小膠質(zhì)細胞中。 3. 組織學形態(tài)結(jié)構(gòu)分析： 在免疫熒光實驗中，有時需要根據(jù)組織學形態(tài)結(jié)構(gòu)來判斷目標細胞的熒光信號。例如，在復(fù)雜的組織樣本中，細胞類型多樣且分布復(fù)雜，通過觀察組織學形態(tài)可以更準確地識別特定類型的細胞。此外，在進行多種抗體同時標記時，不同的熒光信號可能會重疊或相互干擾，或者在抗體特異性不夠高導致背景染色較強的情況下，結(jié)合組織學形態(tài)可以幫助更好地判斷熒光信號的來源。這種方法在實驗條件不理想時尤為重要，有助于提高實驗結(jié)果的準確性和可靠性。 舉例：本期介紹的Col1a2-iCre小鼠（產(chǎn)品編號：C001528）因為熒光抗體與細胞標記抗體雙染效果不佳，則選擇組織學形態(tài)結(jié)構(gòu)分析，最終確認皮膚真皮層、心肌細胞之間、心臟瓣膜及心內(nèi)膜、肺支氣管、肺泡發(fā)生Cre重組的細胞主要為成纖維細胞。 4. 體外培養(yǎng)細胞 某些細胞類型由于其特殊的生物學特性，無法通過流式細胞術(shù)等技術(shù)分選出來。這些細胞通常需要在體外培養(yǎng)條件下維持其特性和功能，以便進行后續(xù)的實驗處理和分析。例如干細胞、特定分化狀態(tài)的細胞等。 以上介紹的方法不是僅固定適用于某一組織或細胞類型，可以聯(lián)合應(yīng)用從多個角度綜合判定Cre重組酶的表達位置，提高實驗結(jié)果的可靠性和準確性。
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